開篇語
假設檢驗，相信大伙兒或多或少都接觸過，比如你的實驗有兩組（實驗組、對照組）資料，你要分析一下它們之間的差異，那么假設檢驗是怎么也繞不過去的步驟，反正你不想做，你導師也會要求你做的，你導師不要求，你投稿時，那些reviewers也會要求你做的……
既然躲不開繞不去，那我們也不用怕它，小編今天就來跟大伙兒好好理一理，假設檢驗到底是啥東東，應該怎么玩！
基本概念與套路
什么是假設檢驗呢？從字面上看，肯定得先有個假設對吧，然后我們就來檢驗這個假設是不是成立，聽上去很簡單嘛！說得專業一點其實也不難理解，就是根據得到的資料，對我們預先設定的假設進行統計學檢驗，最后判斷結果是否有統計學意義，
基本套路一般是：
套路清楚后，我們現在來拆解套路：
根據問題 提出假設
什么是“假設（hypothesis）”呢？牛津詞典中有這樣的解釋：A supposition or proposed explanation made on the basis of limited evidence as a starting point for further investigation，看著有點暈是不是？我們來個通俗的理解就是，當我們沒有足夠的證據（即先驗知識）來說明一個問題時，我們可以先給出一個假定的說明，這個預先給出的假定說明，我們通常稱為原假設或者零假設，與之對應的，我們還可以提出一個對立假設，又稱為備擇假設，
舉個例子，當我們拿到一個硬幣，想研究一下它的正反面是否均勻，我們可以先假設它是不均勻的，這個就是零假設；那么對應的，它正反面是均勻的，就是備擇假設，
PS：一般來說（并不絕對），原假設就是需要我們收集證據來反對的假設，而備擇假設就是需要收集證據來支持的假設，
擴展閱讀 為啥有了零假設，我們還需要弄一個對應的備擇假設呢？對備擇假設的重要性，
90多年前，英國著名的統計學家哥色特（其筆名就是Student）曾舉例解釋過這個問題，
他的主要思想就是人們往往都傾向于選擇相信概率比較大的事件，
比如一些來自于正態總體的資料，現想檢驗它們的均值是不是等于a0？
假設得到檢驗的概率值為0.0001，雖然這個值很小，但是你不能認為這批資料的均值不等于a0，為什么呢？
因為這時候你只有一個a0供你檢驗，概率值再小，也不能否認它發生的可能性，
而此時，如果你再有一個“備胎”（值為a1）讓你去檢驗，最后檢驗的概率值為0.05，比前面的值大很多，
這時候你就會傾向于選擇后面a1這個值，而認為原來的a0不真，
所以，我們需要有“比較”，多一個“備胎”，多一份選擇！（此例子原型來源于《數理統計學簡史》），
“假設”通常有三種形式，以我們最熟悉的生物樣本資料的差異分析來舉例，當我們分析的是單個樣本時，我們可以比較這個樣本的資料與一個已知值的關系，是大于，小于，還是等于，
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單個樣本的假設的形式如下所示（其中H0為原假設，H1為備擇假設，θ0為已知的值）：
所謂單邊檢驗，就是檢驗我們拿到的資料與一個已知值相比，是否大于等于它（或者小于等于它，你可以理解為，只需要判斷數軸一側的大小關系，所以叫單邊檢驗），雙邊檢驗就是看兩個值是否相等（你可以理解為，既不能大于，也不能小于，兩邊不等的情況都得排除，所以叫雙邊檢驗），
當我們分析的是兩個樣本，考察它們之間是否存在差異，也有三種情況，就是樣本1的值大于等于樣本2，或者小于等于樣本2，或者樣本1與樣本2相等，
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兩個樣本的假設的形式如下圖（其中H0為原假設，H1為備擇假設）：
再有一種情況就是分析多個樣本之間的差異，這時候就無所謂大于小于這些單邊檢驗了，只有全部相等（或不全相等）的情況，
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多個樣本之間的情況如下圖所示：
如果上面的解釋和公式你還是覺得有點暈，那么我們來舉個例子，以蛋白質定量資料為例，分析兩組資料之間是否存在差異，我們假設現在有兩大組資料（R, C），每一組得到5次生物學重復資料，得到資料如下：
比如我們想看蛋白質P12242在R組和C組的平均表達量（分別設為μ1，μ2）是否一致，也就是說，要么相等，要么不等，大伙兒可以對照著看看上面提到的兩個樣本雙邊檢驗的說明，此時我們做原假設H0，即該蛋白質在兩組中表達量相等（μ1=μ2），那么備擇假設就是H1，即該蛋白質在兩組中表達量不相等（有差異，即μ1≠μ2），
假設給出來以后，我們一般會先選定一個顯著性水平a，也就是一個判斷的閾值，當統計分析出來的p值小于這個閾值時，說明是有統計顯著性的，可以推翻原假設，通常可以設為0.05，嚴格一點可以設定為0.01，具體設多少要根據你的實驗設計和目的，可以做一定的調整，
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為啥我們要設一個顯著性水平a作為閾值呢？這就得說到假設檢驗中通常愛犯的兩類錯誤（如下表）：第一類錯誤（又稱I型錯誤）是，否定了真實的原假設，即“棄真”，對應上面的例子就是，原假設是蛋白質P12242在兩組中的表達量平均值是沒有差異的，本來它是成立的，結果被你否定了，你認為有差異，這就產生了錯誤；第二類錯誤（又稱II型錯誤）是，接受了錯誤的原假設，即“取偽”，怎么控制第一類犯錯誤的概率呢？就是我們通常說的設定一個顯著性水平α，第二類犯錯誤的概率通常標記為β，
可以告訴你的是，在給定樣本的情況下，減少犯其中一類錯誤的概率，就會導致增加犯另一類錯誤的概率，所以若想同時減少犯兩類錯誤概率，就需要增加樣本的容量，這就是為什么我們在分析差異表達的時候，通常都對樣本量有一定的要求，否則你就算是做了這些假設檢驗，結果也比較難有說服力，當然，增加樣本容量就會增加實驗成本，所以通常建議在能力容許的范圍內，盡可能的多增加一些樣本量，
選擇一種檢驗方法
好，我們繼續說“蛋白質P12242在兩組中的表達量平均值是沒有差異”這個故事，上面的部分我們已經把假設列好了，原假設就是它們沒差異，備擇假設是它們有差異，接下來，我們就得開始檢驗這個假設了，
檢驗假設當然是需要有檢驗方法的！檢驗方法當然是不止一種的！針對這個例子，我們列出幾種常用的假設檢驗的方法，做假設檢驗的一般思路就是，根據某種分布，求出資料對應的統計量，以此來判斷該值是否落入拒絕域中（即拒絕原假設的取值范圍），從而也可以得到對應的概率值P（以前可通過查表得到，現在通過計算機可以快速計算），所以，接下來我們就以各種分布為主線，跟大伙兒聊聊假設檢驗的常見思路，詳細的方法介紹我們會在下一篇推文中進行全面的總結，
正態分布和t分布（T檢驗）
正態分布，大伙兒從小就聽說過吧！它也許是最常見，最重要的一種分布形式了，它雖不是著名數學家Gauss第一個提出的，但是他將之應用于天文學研究，使其廣為人知，所以正態分布通常又稱為高斯分布，
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正態分布的概率密度函式運算式為：
其中m和s為兩個常數，m表征資料的均值，s表征資料的標準差，此時可稱隨機變數X服從引數為m, s的正態分布，記作X~N(m, s2)，
（其中紅線表示的是均值為-2，方差為1的正態分布曲線，藍線表示的是均值為2，方差為4的正態分布曲線，
從中可以看出，方差越小，影像越“瘦高”，方差越大，圖形越“矮胖”，）
t分布是由英國著名統計學家哥色特發表，其筆名是“Student”，所以該分布又稱為“Student t分布”，該分布的公布，標志著小樣本統計推斷的開始，
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其隨機變數T的運算式為：
其中X~N(0, 1)，Y~C-2-(n)，且X，Y相互獨立，其自由度為n，記作T~t(n)，
t分布曲線圖形：
（紅線、藍線、紫線分別是自由度為1、5、100的T分布曲線，大家也許發現了，T分布與正態分布曲線看上去是不是很像，這里主要是因為T分布是為了小樣本的資料分布，當自由度n趨于無窮大時，T分布曲線就越接近標準正態分布曲線，）
下面我們繼續使用上面蛋白質定量資料的例子，來說明一下t.test函式的使用：
現在我們想檢驗蛋白質P12242在R組和C組的平均表達量（分別設為μ1，μ2）是否一致，我們已經設定好了原假設H0，即該蛋白質在兩組中表達量相等（μ1=μ2），那么備擇假設就是H1，即該蛋白質在兩組中表達量不相等（有差異，即μ1≠μ2），
然后我們選擇一種檢驗方法，這里我們假設兩組資料滿足正態分布，所以我們選擇用T檢驗來評估它們是否有差異（如何判斷資料是否滿足某種分布，這個問題后面我們會再講），
讀入資料，
在R語言中可以直接使用t.test函式可進行T檢驗，函式原型為：
其中x, y是我們樣本資料構成的向量，alternative表示備擇假設的形式，“two.sided”表示雙邊檢驗（H1: μ1≠μ2）， “less”表示單邊檢驗（H1:μ1<μ2），“greater”表示單邊檢驗（H1:μ1>μ2），paired表示樣本是否是配對的，var.equal表示兩總體方差是否相等，
在這個例子中，t.test函式呼叫如下：
最后得到P值等于0.0001212，小于0.05，可以支持我們拒絕原假設，即我們認為蛋白質P12242在R組和C組的平均表達量不相等，
通過以上的假設檢驗，我們就可以挑選出表達差異的基因/蛋白質，進行后續生物學意義上的注釋、分類、聚類、相互作用關系分析等，
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怎么判斷兩樣本是否配對？一般出現以下情況中的任意一種，就認為是配對的：
-
配對的兩個受試物件分別接受兩種不同的處理；
-
同一受試物件接受兩種不同的處理；
-
同一受試物件處理前后的結果進行比較（即自身配對）；
-
同一物件的兩個部位給予不同的處理，
F分布（方差分析）
另一種常用來評估各資料組均數之間差異的方法叫方差分析，用這種方法，可以評估所有觀測資料之間的波動程度，不同組之間的波動，以及組內資料的波動，
與方差分析相關的是F分布，由1924年英國統計學家R.A.Fisher提出，所以用Fisher的第一個字母F來命名，假設有兩個獨立的隨機變數，這兩個變數都分別符合卡方分布，它們相除以后的比率，我們就用F分布來描述，
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假設樣本X~c2(n)，Y~c2(m)，且X和Y相互獨立，則稱隨機變數F：
服從自由度為（n, m）的F分布，記作F~F（n, m），使用R語言畫出F分布曲線及R代碼如下：
在R語言中，我們通常使用aov函式進行計算分析：
其中formula是方差分析的公式，data就是我們的資料集，其是資料框的形式，
formula中各符號表達的含義可以參考《R語言實戰》一書，在使用的程序中要注意不要搞混了：
我們來舉個例子說說aov的使用，比如分析小白鼠接種了3中不同菌型的傷寒桿菌后，平均存活的天數有無顯著差異？原始資料如下：
代碼實作：
從結果中得p值為0.0012，小于0.05，即認為3組小鼠的平均存活天數有顯著性差異，
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在進行aov函式分析之前，我們一般要對資料進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，在R語言中常用到的函式分別為shapiro.test和bartlett.test，只有滿足要求的資料，我們才能進行該方法的計算，對于不滿足要求的資料，
我們可以采用秩和檢驗的方法，比如KW秩和檢驗（使用kruskal.test函式）或者Friedman秩和檢驗（使用friedman.test函式），它們的詳細使用我們計劃在下一篇推文中詳細介紹，
卡方分布（卡方檢驗）
上面我們講了針對資料差異分析的檢驗方法，接下來跟大伙兒聊聊如何檢驗資料是否符合某種分布，包括對列聯表的小樣本量資料的檢驗，
話說，如果有n個相互獨立的隨機變數，它們都服從標準正態分布，那么這n個隨機變數的平方和可以構成一個新的隨機變數，這個新的隨機變數分布的規律稱為卡方分布，是不是很厲害的樣子？
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卡方分布的形式是這樣的，我們假設樣本Xi~N(0,1)，其中i=1,2,3…n，則隨機變數Y：
則稱Y~c2(n)，即Y服從自由度為n的卡方分布
R語言代碼如下:
圖形如下（其中紅線、藍線、紫線分別是自由度為1、4、10的卡方分布曲線），
如果以卡方分布為理論依據進行假設檢驗，這種檢驗方法我們稱為卡方檢驗，
卡方檢驗主要用在兩個方面：
a. 檢驗資料是否服從某種分布，比如卡方分布、均勻分布、泊松分布、正態分布等
b. 檢驗列聯表資料，
Tips
啥叫列聯表呢？其實就是互動分類表，互動分類是同時依據兩個或多個變數的值，
將所研究的個案分類，互動分類的目的是將兩個或者多個變數分組，
然后比較各組的分布狀況，以尋找變數間的關系，比如下面這個列聯表，
就是依據是否吸煙與是否患肺癌進行分類，然后可以通過比較這些數值，尋找吸煙與患肺癌之間是否相關，
R語言中使用chisq.test函式進行計算：
其中x, y為資料向量，correct表示是否進行連續性修正；p表示原假設落在某區間的理論概率，默認的是均勻分布；rescale.p=FASLE的意思是要求輸入的p之和要等于1；simulate.p.value表示是否使用仿真的方法計算p值，B是指仿真的次數，
檢驗資料是否服從某種分布
說了這么多，到底我怎么檢驗我們的資料是符合什么分布呢？接下來我們就來舉個例子，
我們都知道，不管是中考、高考、還是某類大型考試，某部門一般都愛要求老師給學生打的成績要服從正態分布，那么現在假設我們得到了這樣一批學生的成績，我們想來檢驗下這批學生的成績是否服從正態分布呢？
代碼如下：
從結果中可得p值等于0.06161，大于0.05，可認為此次老師批閱試卷的成績服從正態分布，
在檢驗資料服從某種分布時，我們還可以使用Kolmogorov-Smirnov檢驗，也是可以用于檢驗各種常見的分布，其函式是ks.test，比如還是上面那個例子，其代碼實作如下：
得到的p值為0.2162，也是大于0.05，得的結論與上面一致，即此次的成績符合正態分布，
檢驗列聯表資料
列聯表是啥剛才已經解釋過了，我們常見的就是2x2的列聯表形式，還是吸煙與肺癌的例子：
代碼實作如下：
所得的p值為0.004855，小于0.05，可以認為吸煙與患癌病有關，
檢驗列聯表資料時，我們還常會用到Fisher檢驗，該檢驗是建立在超幾何分布的基礎上，當樣本量比較小時（這里有個經驗值，頻數小于4），一般建議使用該檢驗方法，
Tips 1）超幾何分布：是統計學上一種離散概率分布，描述的是，從有限個物件中抽出n個物件，
成功抽出指定型別的物件的次數（不歸還），比如，在產品質量的抽檢中（抽出來的不放回去），
如果N件產品中有M件次品，抽檢n件時所得次品數X，就服從超幾何分布， 2）頻數：也稱“次數”，對整個資料按某種標準分組，然后統計出各個組內含個體的個數，
比如上面例子中，有一個頻數為3（不吸煙患肺癌這一組），所以這里建議使用Fisher檢驗，其代碼實作如下：
所得的p值為0.00282，小于0.05，所得結論與上面一致，且這里還給出了優勢比（odds ratio）的值，該值大于1，其含義是吸煙越多，患肺癌的可能性就越大，
求得P值，下結論
其實在第2部分我們舉例說明的時候就已經做了這一步，在這里，我們想著重說明一下的是：
a. 在我們下結論的時候，其實是用了一個大家廣泛接受的原則：在一次試驗中，小概率事件基本上不會發生，若它正好發生了，那么我們就有理由懷疑原假設的準確性；
b. 對于顯著性水平a的大小（比如0.01, 0.05, 0.1之類），這個大小沒有一個絕對的定值，只要你能說出一些合理的理由，你完全可以調整這個值的界限，若是對這些約定俗成的值感興趣的，可以去看看那些老前輩的文章（比如《Statistical methods for research workers》）；
c. 從前面描述，我們都可以看出，我們所下結論時都是根據p值而來，所以，在描述結論的時候一定不能下絕對的結論，比如“認為3組小鼠的平均存活天數一定（或肯定）有差異”，這種結論是不嚴謹的；
d. 我們所說的“具有顯著性差異”，這個表現不出具體差異的大小，只能說明它們存在差異，所以，這也是我們在分析資料時，經常會看到大家不僅關注p值，還同時關注倍數（fold change）變化的原因，這種可視化表現形式尤其以火山圖最為著名，
P值校正方法小匯總：https://mp.weixin.qq.com/s/YzaIXvkoEWuaxoZqYMCedg
假設檢驗方法集合：https://mp.weixin.qq.com/s/zHNwKhj6sywHLa8MuDjMcg
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